Jennifer Aniston sinh tại Sherman Oaks, California,[12][13] là con gái của diễn viên John Aniston và nữ diễn viên Nancy Dow (1936-2016).[13][14] Cha Aniston là người Mỹ gốc Hy Lạp, trong khi mẹ cô sinh tại Thành phố New York.[15] Một trong những tổ tiên của cô có dòng máu Ý[16] và mẹ cô có nguồn gốc từ Anh, Ireland, Scotland và Hy Lạp. Aniston có hai người anh em cùng cha khác mẹ, John Melick (lớn) và Alex Aniston (nhỏ). Cha đỡ đầu của Aniston là diễn viên Telly Savalas, người bạn thân của cha cô.[17]

Khi còn nhỏ cô sống ở Hy Lạp trong một năm với gia đình, sau đó họ chuyển tới Thành phố New York.[18] Cha cô đã xuất hiện trong các bộ phim truyền hình Days of our Lives, Love of Life và Search for Tomorrow.[18] Aniston theo học Trường Rudolf Steiner ở New York[19] và tốt nghiệp trường Cao học Âm nhạc và Nghệ thuật và Nghệ thuật trình diễn Fiorello H. LaGuardia tại Manhattan. She worked in Off Broadway productions such as For Dear Life and Dancing on Checker's Grave.[18] Cô đã làm nhiều công việc bán thời gian để kiếm sống, gồm cả nhân viên marketing từ xa và đưa thư bằng xe đạp.[18] Năm 1989, cô tới Los Angeles, California.[20]